Преобразование одного типа клеток в другой — например, клетки кожи в нейрон — может быть осуществлено с помощью процесса, который требует, чтобы клетка кожи была индуцирована в “плюрипотентную” стволовую клетку, а затем дифференцирована в нейрон. Исследователи Массачусетского технологического института разработали упрощенный процесс, который обходит стадию получения стволовых клеток и превращает клетку кожи непосредственно в нейрон.
Работая с мышиными клетками, исследователи разработали высокоэффективный метод преобразования, который позволяет получать более 10 нейронов из одной клетки кожи. Если этот подход будет воспроизведен в клетках человека, он позволит генерировать большое количество двигательных нейронов, которые потенциально могут быть использованы для лечения пациентов с травмами спинного мозга или заболеваниями, нарушающими подвижность.
“Нам удалось получить результаты, на которых мы могли бы задать вопросы о том, могут ли эти клетки быть жизнеспособными кандидатами для заместительной терапии, на что мы надеемся. Вот к чему могут привести нас подобные технологии перепрограммирования”, — говорит Кэти Гэллоуэй, профессор по развитию карьеры в области биомедицинской инженерии и химической инженерии в университете У.М. Кека.
В качестве первого шага к разработке этих клеток в качестве терапии исследователи показали, что они могут генерировать двигательные нейроны и внедрять их в мозг мышей, где они интегрируются с тканями хозяина.
Гэллоуэй является старшим автором двух статей, описывающих новый метод, которые сегодня публикуются в журнале Cell Systems. Аспирант Массачусетского технологического института Натан Ванг является ведущим автором обеих статей.
От кожи к нейронам
Почти 20 лет назад японские ученые показали, что, доставляя четыре фактора транскрипции в клетки кожи, они могут превратить их в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Подобно эмбриональным стволовым клеткам, ИПСК могут дифференцироваться во многие другие типы клеток. Этот метод хорошо работает, но он занимает несколько недель, и многие клетки в конечном итоге не полностью переходят к зрелым типам клеток.
“Часто одна из проблем при перепрограммировании заключается в том, что клетки могут застрять в промежуточных состояниях”, — говорит Гэллоуэй. “Итак, мы используем прямое преобразование, при котором вместо прохождения через промежуточный этап iPSC мы переходим непосредственно от соматической клетки к двигательному нейрону”.
Исследовательская группа Гэллоуэй и другие исследователи ранее демонстрировали этот тип прямого преобразования, но с очень низким выходом — менее 1 процента. В предыдущей работе Гэллоуэй использовала комбинацию из шести факторов транскрипции и двух других белков, которые стимулируют пролиферацию клеток. Каждый из этих восьми генов был доставлен с использованием отдельного вирусного вектора, что затрудняло обеспечение того, чтобы каждый из них экспрессировался на нужном уровне в каждой клетке.
В первой из работ о новых клеточных системах Галлоуэй и ее студенты рассказали о способе оптимизации процесса, позволяющем превращать клетки кожи в двигательные нейроны, используя всего три фактора транскрипции, а также два гена, которые приводят клетки в состояние высокой пролиферации.
Используя мышиные клетки, исследователи начали с первоначальных шести факторов транскрипции и экспериментировали с их удалением по одному, пока не получили комбинацию из трех — NGN2, ISL1 и LHX3, — которые могли бы успешно завершить преобразование в нейроны.
Как только число генов сократилось до трех, исследователи смогли использовать один модифицированный вирус для доставки всех трех из них, что позволило им гарантировать, что каждая клетка экспрессирует каждый ген на нужном уровне.
Используя отдельный вирус, исследователи также ввели гены, кодирующие p53DD, и мутировавшую версию HRAS. Эти гены заставляют клетки кожи многократно делиться, прежде чем они начнут превращаться в нейроны, что обеспечивает гораздо более высокий выход нейронов — около 1100 процентов.
“Если бы вы экспрессировали факторы транскрипции на действительно высоком уровне в непролиферативных клетках, скорость перепрограммирования была бы действительно низкой, но гиперпролиферативные клетки более восприимчивы. Это похоже на то, что они были усилены для преобразования, и тогда они становятся гораздо более восприимчивыми к уровням транскрипционных факторов”, — говорит Гэллоуэй.
Исследователи также разработали несколько иную комбинацию факторов транскрипции, которая позволила им выполнить такое же прямое преобразование с использованием клеток человека, но с более низкой эффективностью — от 10 до 30 процентов, по оценкам исследователей. Этот процесс занимает около пяти недель, что немного быстрее, чем сначала преобразование клеток в ИПСК, а затем в нейроны.
Имплантация клеток
Как только исследователи определили оптимальную комбинацию генов для доставки, они начали работать над наилучшими способами их доставки, что и было предметом второй статьи о клеточных системах.
Они опробовали три разных вируса для доставки и обнаружили, что ретровирус обеспечивает наиболее эффективную скорость превращения. Уменьшение плотности клеток, выращиваемых в чашке, также помогло повысить общий выход двигательных нейронов. Этот оптимизированный процесс, который занимает около двух недель в клетках мыши, позволил получить выход более 1000 процентов.
Затем, работая с коллегами из Бостонского университета, исследователи проверили, могут ли эти двигательные нейроны быть успешно привиты мышам. Они доставили клетки в часть мозга, известную как полосатое тело, которая отвечает за управление движениями и другие функции.
Через две недели исследователи обнаружили, что многие из нейронов выжили и, по-видимому, формируют связи с другими клетками мозга. При выращивании в чашке эти клетки демонстрировали заметную электрическую активность и кальциевую сигнализацию, что свидетельствует о способности взаимодействовать с другими нейронами. Теперь исследователи надеются изучить возможность имплантации этих нейронов в спинной мозг.
Команда Массачусетского технологического института также надеется повысить эффективность этого процесса преобразования клеток человека, что позволит генерировать большое количество нейронов, которые можно будет использовать для лечения травм спинного мозга или заболеваний, влияющих на двигательный контроль, таких как БАС. В настоящее время проводятся клинические испытания с использованием нейронов, полученных из ИПСК, для лечения БАС, но увеличение количества клеток, доступных для такого лечения, может облегчить их тестирование и разработку для более широкого применения на людях, говорит Гэллоуэй.
Источник: MIT
